肝脏是药物代谢和毒性反应的关键器官。原代肝细胞（Primary Hepatocytes）具备完整的生物特性和生理水平的酶及辅助因子，包括膜结合酶（如细胞色素P450混合功能氧化酶）和胞质酯酶，涵盖了肝脏的所有代谢途径。因此，原代肝细胞被广泛认为是体外肝脏模型的金标准，被研究者在药物相互作用、药物代谢和药物毒性研究中广泛应用。本文将概述基于原代肝细胞的二维（2D）和三维（3D）培养模型及其在药物研发中的实际应用。

一、原代肝细胞分离

原代肝细胞的分离一般采用两步胶原酶灌注法。对于小型动物，使用门静脉或下腔静脉进行肝脏灌注，而大型动物则通过肝叶或肝节段进行灌注。成功的肝细胞分离依赖于几个关键因素：首先，所用胶原酶需无细胞毒性；其次，需把握合适的消化时机，避免消化不足或过度；最后，肝脏状态良好以减少缺血性损伤。标准的原代肝细胞用于药物研究的要求包括：实验开始时活率80%以上，实验过程中活率下降不超过20%；对2-3种已知药物代谢的检测结果应与文献值相符；使用典型诱导剂时，特定酶的活性应显著增加；以及冷冻肝细胞在接种后4-6小时的贴壁率应达到70%。

二、原代肝细胞的二维培养

悬浮肝细胞（Suspension Hepatocytes）模型拥有完整的药物代谢酶和辅助因子，适用于不同的代谢路径研究。然而，随着体外孵育时间的延长，悬浮肝细胞的活率和酶活性会降低，孵育时间限制在4小时内。传统的悬浮肝细胞代谢研究模型无法产生足够的代谢反应，限制了对慢代谢化合物的预测能力。可以通过悬浮肝细胞接力法延长孵育时间至20小时以上，以进行小分子药物的酶活性和代谢稳定性研究。此外，贴壁肝细胞（Plateable Hepatocytes）模型在胶原蛋白包被的培养表面进行，其缺陷在于细胞极性与功能改变，缺乏其他相关细胞类型及营养供给。该模型在药物-药物相互作用、肝毒性评估及慢代谢化合物清除率研究中显示出重要应用价值。

三、原代肝细胞的三维培养

球状体（Spheroid）模型利用超低粘附培养等技术将原代肝细胞聚集成直径达150-175µm的球状团。研究表明，球状体培养可维持CYP酶活性长达5周，而肝小叶的复杂结构暂时无法在模型中复现。肝类器官（Liver Organoids）模型则是来源于干细胞的3D结构，能够再现肝脏的功能与结构，促进对肝病机制的研究。采用成熟肝细胞构建的类器官在遗传稳定性上表现优异，成为研究药物性肝损伤和慢代谢机制的重要工具。

四、原代肝细胞共培养模型

2D原代肝细胞共培养模型将不同类型细胞混合培养，能保持原代肝细胞的功能长达3周。原代肝细胞与成纤维细胞共培养，以研究慢代谢化合物的清除率；与非实质肝细胞共培养，用于探究药物性肝损伤机制。直接和间接的3D共培养模型能够实现多种肝细胞之间的信号通信，助力于构建肝纤维化及药物性肝损伤模型。

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