细胞介导的细胞毒性原理是免疫系统将损伤细胞在体内溶解的重要现象。区分活细胞与死细胞是研究细胞增长控制与凋亡的关键。活/死细胞双重染色试剂盒为评估细胞活力提供了一种便捷的测定方法，该方法基于利用两种探针同时分析活细胞和死细胞，从而测量细胞健康的公认参数：细胞膜完整性和细胞内酯酶活性。该试剂盒采用绿色荧光染料Ca-AM（Ex/Em=488/530nm）染色活细胞，同时使用红色荧光染料PI（Ex/Em=535/617nm）来标记死细胞。

在进行实验时，所需耗材包括24孔板、可调式移液枪及枪头、离心机、荧光显微镜或流式细胞仪、去离子水和PBS。试剂准备方面，Ca-AM和PI需在冰上避光保存；1×AssayBuffer需用去离子水将10×稀释，使用前需加热至37℃。Staining Solution的制备为在每1 mL AssayBuffer中加入1µL Ca-AM和1µL PI，具体根据样本数量进行调整。

实验步骤

A. 流式细胞术定量

1. 按预期方法处理细胞。注意：建议为所有处理及未处理样本建立未染色对照组，悬浮于1×AssayBuffer中，以便进行流式细胞分析；

2. 对于非贴壁细胞，收集1-5×10⁵个细胞并在4℃下以300 g离心5分钟，用预冷PBS洗涤两次，弃去PBS。对于贴壁细胞，需先用胰蛋白酶消化再离心；

3. 将细胞悬浮于500 µL Staining Solution中；

4. 在37℃避光条件下孵育15到30分钟；

5. 使用流式细胞仪进行分析。

B. 荧光显微镜检测

1. 对于悬浮细胞，按照步骤A1至A4操作，将步骤A4的细胞悬液置于载玻片上，盖上玻璃盖玻片，尽快使用适当滤光片进行荧光显微镜分析；

2. 对于贴壁细胞，建议依照以下步骤操作：（1）在六孔板的盖玻片上培养细胞，放于CO₂细胞培养箱中37℃培养至少24小时后再进行后续实验；（2）用预期方法处理细胞，并在无诱导剂条件下孵育以建立阴性对照；（3）用PBS洗涤细胞两次；（4）向细胞中添加0.5 mL Staining Solution，在黑暗中于37℃孵育15至30分钟；（5）用PBS洗涤细胞两次；（6）将盖玻片覆盖在载玻片上，尽快使用适当的滤光片进行荧光显微镜分析。

注意：PI作为潜在的诱变因子，使用时需采取适当的防护措施；Ca-AM需在干燥、低温、避光的条件下储存，温度为-20℃。

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