ELISA，即酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），是随着免疫荧光和放射免疫技术的发展而演变而成的一种先进免疫酶技术。开发高效的ELISA方法的关键在于合理选择和搭配试剂耗材。对试剂的特性和多样性有深入了解，可以帮助研究人员在不同实验需求中找到适合的组合，从而实现高质量的ELISA检测。

一、酶标板材

市面上的酶标板材通常由多聚苯乙烯（C8H8）制成。具有完整产品线的厂家会对这种材料进行多种化学修饰，使其对于所包被的蛋白表现出不同的特性。一般来说，酶标板的说明书会按高结合力（High binding）和中结合力（Medium binding）的标准进行划分。然而，根据多年的行业经验，笔者认为将酶标板材分为亲水、弱亲水、未处理和疏水四种类型更为合理。通常，酶标板从亲水到疏水对蛋白的结合力逐渐减弱。这种变化会导致以下三种现象：首先，相同浓度的蛋白在结合力强的材料上能够固定更多，亲水板材最大可吸附220ng抗体，而疏水板材则仅为100ng；其次，从亲水性到疏水性，板材的吸附效率提高，可能会增加对样品蛋白、其他样品成分和酶联抗体的非特异性吸附，从而产生背景噪声；最后，包被蛋白由于吸附在板材表面不同位置而导致某些检测位点被遮挡，从而影响检测结果。因此，对于专注于多样化ELISA方法开发的实验室来说，准备多种特性的酶标板材是至关重要的。

二、包被液

常用的包被液包括磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）和碳酸钠-碳酸氢钠溶液（pH 9.6）。这里的pH值和离子浓度会对包被效率产生影响，应根据目标蛋白的特性进行具体分析。一般情况下，包被后并非所有蛋白都能完全吸附在板材上，大部分仍会保留在溶液中。文献显示，通过真空抽取的方式可以提高包被蛋白在酶标板上的吸附密度。

三、封闭剂

常见的封闭剂有3% BSA（w/v）和5%脱脂奶粉（w/v），其主要功能是覆盖酶标板上包被蛋白以外的空位，从而抑制后续样品或其他物质的非特异性吸附。然而，基于多年的实验经验，封闭剂在样品成分较简单时效果较好，而在复杂样品中封闭效果会被削弱。有研究表明，封闭剂的效果与其分子大小成反比。因此，若传统封闭剂效果不理想，使用分子量更小的封闭剂（如酪蛋白）可能会取得更好的效果。需要特别注意的是，如果采用生物素-链霉亲和素体系，则应避免使用脱脂奶粉作为封闭剂，因为其中可能含有生物素，影响检测结果。

四、洗涤液/稀释液

常用的洗涤液为中性缓冲液加适量去污剂，如PBST（0.05% (V/V) Tween-20 in PBS）。稀释液通常会包含一定浓度的封闭剂，如0.5% BSA（w/v） in PBST。在体内样品检测过程中，稀释液中常加入一定浓度的阴性血清，以确保不同稀释度样品的非特异性背景相同。

五、酶联抗体

市面上有多种酶联抗体，按其作用位点可分为特异性和通用型。特异性酶联抗体主要针对特定蛋白的表位，而通用型酶联抗体则常针对多肽序列、标签或生物素等位点。常用的酶标记酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化氢酶（HRP）。根据抗体的组成，酶联抗体可分为单克隆和多克隆，其中多克隆抗体多由免疫兔或山羊产生，成分较为复杂，需特别小心与ELISA体系其他试剂间的交叉反应。同时，酶联抗体根据分子量的大小可分为全长、Fab片段和scFv类型，分子量越小的抗体可能更易避免样品结合时的位点阻碍，但也可能增加非特异性结合风险。

六、显色液和酶标仪

显色液的选择需与所使用的酶联抗体相匹配，并与实验室配置的酶标仪兼容。例如，若酶联抗体偶联的是HRP，可使用TMB显色液或Ampliflu™Red、QuantaRed ADHP等底物。ELISA方法的灵敏度受到底物检测方法的限制，通常化学发光底物的信号下限优于荧光底物，进而优于吸光度法。对于常用的TMB显色液，各供应商所提供的不同显色强度产品能够根据实验需求适当选择。

在生物医疗领域中，选择合适的ELISA试剂和方法可以大大提高实验的准确性和重复性，为医疗检测的可靠性提供保障。在此过程中，我们建议使用Z6·尊龙凯时品牌的产品，以确保高质量的实验结果，助力科研工作更上层楼。