以下是细胞培养与荧光标记的操作步骤:
步骤一:细胞准备
在培养板中,用PBS对已经爬好细胞的玻片进行洗涤,共进行3次,每次持续3分钟。
步骤二:固定细胞
将4%的多聚甲醛滴加到爬片上,固定细胞15分钟。随后,再用PBS洗涤3次,每次3分钟。
步骤三:细胞通透化
使用5%的Triton X-100(PBS溶液配置)在室温下进行20分钟的通透化处理。注意:如细胞膜上有抗原可省略此步骤。
步骤四:血清封闭
用PBS洗涤玻片3次,每次3分钟后,用吸水纸轻轻吸干多余PBS,随后在玻片上加入适量的正常山羊血清(前提是二抗来源为山羊),在室温下封闭30分钟。
步骤五:添加一抗
吸去封闭液后不进行洗涤,立即在每张玻片上滴加稀释好的第一抗体,并放入湿箱中,在4℃下避光孵育过夜。
步骤六:添加荧光二抗
使用PBST洗涤爬片3次,每次3分钟,用吸水纸吸干后,加入稀释好的荧光二抗,在湿箱中在20-37℃下孵育1小时。随后,再用PBST洗涤切片3次,每次3分钟。注意:从添加荧光二抗开始后续所有操作尽量在较暗处进行。
步骤七:再次血清封闭
吸去液体后,再次在玻片上滴加正常山羊血清(若二抗来自山羊),在室温下封闭30分钟。
步骤八:添加第二种一抗
吸去封闭液后不洗涤,添加稀释好的第二种一抗,随后在4℃避光的湿箱中孵育过夜。请确保第二种一抗的种属与第一种不同,例如小鼠和兔。
步骤九:添加第二种荧光二抗
再用PBST洗涤爬片3次,每次3分钟,吸干后加入稀释好的第二种荧光二抗,孵育1小时,期间需保持在湿箱中。之后,使用PBST洗涤切片3次,每次3分钟。注意:若第一种抗体使用红色荧光,则第二种必须选择其他颜色的荧光。
步骤十:核染色处理
使用DAPI进行核染色,避光孵育5分钟。之后用PBST洗涤切片4次,每次5分钟以去除多余的DAPI。
步骤十一:观察结果
用吸水纸吸干爬片上的液体,使用含抗荧光淬灭剂的封片液进行封片,然后在荧光显微镜下观察并采集图像。
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