以下是细胞培养与荧光标记的操作步骤：

步骤一：细胞准备

在培养板中，用PBS对已经爬好细胞的玻片进行洗涤，共进行3次，每次持续3分钟。

步骤二：固定细胞

将4%的多聚甲醛滴加到爬片上，固定细胞15分钟。随后，再用PBS洗涤3次，每次3分钟。

步骤三：细胞通透化

使用5%的Triton X-100（PBS溶液配置）在室温下进行20分钟的通透化处理。注意：如细胞膜上有抗原可省略此步骤。

步骤四：血清封闭

用PBS洗涤玻片3次，每次3分钟后，用吸水纸轻轻吸干多余PBS，随后在玻片上加入适量的正常山羊血清（前提是二抗来源为山羊），在室温下封闭30分钟。

步骤五：添加一抗

吸去封闭液后不进行洗涤，立即在每张玻片上滴加稀释好的第一抗体，并放入湿箱中，在4℃下避光孵育过夜。

步骤六：添加荧光二抗

使用PBST洗涤爬片3次，每次3分钟，用吸水纸吸干后，加入稀释好的荧光二抗，在湿箱中在20-37℃下孵育1小时。随后，再用PBST洗涤切片3次，每次3分钟。注意：从添加荧光二抗开始后续所有操作尽量在较暗处进行。

步骤七：再次血清封闭

吸去液体后，再次在玻片上滴加正常山羊血清（若二抗来自山羊），在室温下封闭30分钟。

步骤八：添加第二种一抗

吸去封闭液后不洗涤，添加稀释好的第二种一抗，随后在4℃避光的湿箱中孵育过夜。请确保第二种一抗的种属与第一种不同，例如小鼠和兔。

步骤九：添加第二种荧光二抗

再用PBST洗涤爬片3次，每次3分钟，吸干后加入稀释好的第二种荧光二抗，孵育1小时，期间需保持在湿箱中。之后，使用PBST洗涤切片3次，每次3分钟。注意：若第一种抗体使用红色荧光，则第二种必须选择其他颜色的荧光。

步骤十：核染色处理

使用DAPI进行核染色，避光孵育5分钟。之后用PBST洗涤切片4次，每次5分钟以去除多余的DAPI。

步骤十一：观察结果

用吸水纸吸干爬片上的液体，使用含抗荧光淬灭剂的封片液进行封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。

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